Presença de marcadores de células-tronco em linhagens celulares humanas de câncer de mama: possível valor em diagnóstico, prognóstico e terapía / Analysis of stem cells markers in human breast cancer cell lines

O câncer de mama é a doença maligna que mais acomete as mulheres no mundo. Apesar dos inúmeros tratamentos, o óbito se deve principalmente à doença metastática que pode se desenvolver a partir do tumor primário. Esta progressão tumoral decorre da dificuldade de se estabelecer um prognóstico mais preciso. Atualmente, a teoria de células iniciadoras de tumor vem sendo estudada para tentar explicar a biologia do câncer e descrever novos alvos para prognósticos e terapias. O carcinoma mamário foi o primeiro tumor sólido para o qual foi identificada uma subpopulação celular, definida como CD44+/CD24-, apresentando as características de células iniciadoras tumorais. Embora este fenótipo venha sendo muito utilizado para descrever as células iniciadoras tumorais de mama, muitos trabalhos tem questionado a relevância clínica desses marcadores, enfatizando que outros marcadores devem ser identificados. Assim, o objetivo deste trabalho é analisar e caracterizar marcadores de células-tronco que possam estar relacionados com o grau de malignidade no modelo de câncer de mama. Inicialmente, analisou-se a expressão de 10 marcadores de células-tronco em diferentes linhagens de câncer de mama que apresentam graus crescentes de malignidade. O CD90 foi selecionado devido à alta expressão desse marcador na linhagem mais agressiva Hs578T. Para a caracterização deste marcador, realizou-se ensaios funcionais, através do silenciamento do CD90 na linhagem tumorigênica Hs579T e sua superexpressão na linhagem não-tumorigênica MCF10A. As linhagens celulares geradas foram caracterizadas quanto ao crescimento celular, potencial invasivo e metastático. Foi possível observar que houve uma alteração da morfologia nas linhagens transformadas com o CD90 e, também, um maior tempo de dobramento na linhagem Hs578T-CD90- e um menor na MCF10A-CD90+. Além disso, a linhagem MCF10-CD90+ foi capaz de crescer independentemente de EGF. Através da análise da via EGF, foi possível observar que houve um aumento da expressão da forma fosforilada do receptor e dos fatores Erk, c-Jun, e Jnk na linhagem MCF10A-CD90+ e uma diminuição dos mesmos na linhagem Hs578T-CD90-. A análise da atividade do elemento responsivo do fator de transcrição AP1 comprovou que a via de EGF é funcional na linhagem MCF10-CD90+. Também foram analisados os marcadores de transição epitélio-mesenquimal, verificando-se aumento da expressão dos marcadores mesenquimais na linhagem MCF10A-CD90+ e diminuição na linhagem Hs578T-CD90-. Os ensaios in vitro de invasão mostraram que as células MCF10-CD90+ são capazes de migrar e invadir e as células Hs578T-CD90- apresentam diminuição significativa da habilidade de migração e invasão. Além disso, os ensaios de metástase in vitro e in vivo, mostraram que a superexpressão de CD90 levou à malignização das células MCF10A. Por outro lado, a linhagem Hs578T-CD90- apresentou menor potencial metastático in vitro. Portanto, neste trabalho, pela primeira vez, o CD 90 foi caracterizado funcionalmente como um marcador envolvido na transformação maligna do carcinoma mamário, contribuindo, assim, para melhor entendimento da biologia do câncer de mama e para que se possa desenvolver novas ferramentas de diagnóstico/prognóstico e novos protocolos clínicos e terapêuticos

Breast cancer is the malignant disease which affects the highest number of women in the world. In spite of the numerous treatments available, death is primarily due to the metastatic disease that may develop from the primary tumor. This tumor progression occurs because of the difficulty in establishing an accurate diagnosis/prognosis. Currently, the tumor initiating cells theory is being applied in an attempt to explain cancer biology and to unveil new diagnostic and therapeutic targets. Mammary carcinoma was the first solid tumor in which a cellular subpopulation, defined as CD44+/CD24-, was associated with tumor initiating cells. Although this phenotype has been widely used to describe breast tumor initiating cells, several studies have questioned the clinical relevance of these markers, emphasizing that additional markers should be identified. The objective of the present study is to analyze and characterize stem cell markers that may be related to malignancy stages in the breast cancer model. Initially, the expression of 10 stem cell markers was analyzed in different breast cancer cell lines displaying different malignancy grades. CD90 was selected due to its high expression levels in the most aggressive cell line, namely: Hs578T. In order to further characterize this marker, a functional study was performed in which CD90 was silenced in the Hs578T tumorigenic cell line and overexpressed in the non-tumorigenic MCF10A cell line. The resulting cell lines were characterized relative to growth rate and invasive and metastatic potential. A change in morphology readily was observed in the cell lines overexpressing CD90. In addition, the Hs578T-CD90-cell line presented an increased doubling time (DT), while the MCF10A-CD90+ cell line displayed a lower DT.. Furthermore, MC10-CD90+ cells were able to grow in the absence of EGF. Analysis of components of the EGF pathwayrevealed increased expression levels of the phosphorylated form of Erk, c-Jun and Jnk receptors in the MCF10-CD90+ cell line, while Hs578T-CD90- cells presented decreased expression of the same factors and receptors. Analysis of the activity of the AP1 responsive element allowed confirmation that the EGF pathway is functional in the MCF10-CD90+. . Epithelial-mesenquimal transition markers presented increased expression levels in the MCF10A-CD90+ cell line, accompanied by decreased expression levels in Hs578T-CD90- cells. In vitro invasion assays showed that MCF10A-CD90+ cells are capable of migrating and invading, while Hs578T-CD90- cells presented a significant decrease in their ability to migrate and invade. Additionally, in vitro and in vivo metastasis assays showed that malignization ensued upon overexpression of CD90 in MCF10A cells and a lower tendency to form metastasis in vitro was observed for the Hs578T-CD90- cell line. Therefore, the present study presents, for the first time in the literature, the functional characterization of CD90 as a genetic marker involved in the malignant transformation of mammary carcinoma, leading to a better understanding of the breast cancer biology, which may, in turn, lead to the development of new clinical and therapeutic protocols

Construction of a recombinant plasmid harbouring the glyceraldenyde-3-phosphate dehydrogenase gene of periodic Brugia malayi and observation on DNA immunity.

Purpose: Controlling and eliminating lymphatic filariasis will require further research of preventative measures and implementation. Parasite is dependent on glycolysis for ATP production. The glycolytic enzyme glyceraldenyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) plays an important role in glycolysis and therefore is either a potential target for anti-parasite drug development or a vaccine candidate. Therefore, we tried to investigate the DNA vaccine-elicited immune responses in BALB/c mice. Materials and Methods: We cloned a gene encoding the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from periodic Brugia malayi into vector pcDNA3.1. Mice were injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA with CpG intramuscular injection and immunized three times at 2-week intervals. pcDNA3.1 and normal saline were used as control. The tissue of muscles at the 4 weeks after the third injection was collected and target genes were detected using RT-PCR. The humoral responses elicited in mice by inoculation with the recombinant plasmid pcDNA3.1-BmGAPDH were detected using a standard ELISA. Two weeks after the third immunization, stimulation index (SI) was measured using the MTT method and the level of secreted IL-4 and INF-g were detected using ELISA. Results: Specific gene fragment coding GAPDH was amplified and the recombinant plasmid pcDNA3.1-BmGAPDH was constructed. Post-challenge sera from the mice immunized with the DNA vaccine had specific antibody titres of 1:1600 to 1:6400, and the highest titre was observed in the mice that were inoculated by pcDNA3.1-BmGAPDH/CpG at 6 weeks. At 4 weeks after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged. The proliferation of spleen T lymphocytes seen on the MTT assay was higher in the pcDNA3.1-BmGAPDH group than in the control group (P value <0.05). The levels of IL-4 and INF-g in serums from the immunized mice were significantly higher than that of the control (P value <0.05). Conclusions: We conclude that the recombinant eukaryotic plasmid pcDNA3.1-BmGAPDH could elicit humoral and cellular immune responses in mice.

Terapia gênica com VEGF para angiogênese na angina refratária: ensaio clínico fase I/II / VEGF gene therapy for angiogenesis in refractory angina: phase I/II clinical trial

OBJETIVO: Avaliar a segurança, viabilidade e efeitos iniciais, clínicos e sobre a perfusão miocárdica, da administração intramiocárdica, transtorácica, de VEGF 165 plasmidial em pacientes com doença arterial coronariana avançada e angina refratária, não passíveis de revascularização percutânea e cirúrgica. MÉTODOS: Ensaio clínico fase I/II. Treze pacientes cardiopatas isquêmicos com angina refratária apesar de tratamento medicamentoso máximo por no mínimo seis meses, não passíveis de revascularização cirúrgica ou por cateter foram submetidos a injeções intramiocárdicas de 2000µg VEGF 165 plasmidial. Os pacientes foram avaliados por cintilografia miocárdica, teste ergométrico, questionário de qualidade de vida (Minnesota) e determinação das classes de insuficiência cardíaca (NYHA) e angina (CCS). RESULTADOS: Não houve óbitos ou reintervenções. Durante o período de tratamento medicamentoso máximo, não se observou diferenças em cintilografias miocárdicas, testes ergométricos e questionários de qualidade de vida, ainda, houve tendência a piora das classes NYHA (P=0,05) e CCS (P=0,05). Três meses após intervenção, observou-se melhora dos escores cintilográficos SSS (18,38±7,51 vs. 15,31±7,29, P=0,003) e SRS (11,92±7,49 vs. 8,53±6,68, P=0,002), porém não na proporção da extensão da área de miocárdio isquêmico (23,38±13,12 por cento vs. 20,08±13,88 por cento, P=0,1). Houve tendência a melhora dos METs nas ergometrias (7,66±4,47 vs. 10,29±4,36, P=0,08), melhora do escore de qualidade de vida (48,23±18,35 vs. 30,15±20,13; P=0,02) e das classes NYHA (3,15±0,38 vs. 1,77±0,83, P=0,001) e CCS (3,08±0,64 vs. 1,77±0,83, P=0,001), no mesmo período. CONCLUSÕES: A terapia demonstrou-se segura e viável nesta série de pacientes. Os resultados iniciais tendem a demonstrar melhora na gravidade da angina e redução da intensidade da isquemia miocárdica.

OBJECTIVE: Safety, feasibility and early myocardial angiogenic effects evaluation of transthoracic intramyocardial phVEGF165 administration for refractory angina in no option patients. METHODS: Cohort study, in which 13 patients with refractory angina under optimized clinical treatment where included, after cineangiograms had been evaluated and found unfeasible by surgeon and interventional cardiologist. Intramyocardial injections of 5mL solution containing plasmidial VEGF165 where done over the ischemic area of myocardium identified by previous SPECT/Sestamibi scan. Evaluations included a SPECT scan, stress test, Minnesotta QOL questionnaire and NYHA functional class and CCS angina class determinations. RESULTS: There were no deaths or new interventions during the study period. There were no significant variations in SPECT scans, QOL scores and stress tests results during medical treatment in the included patients. After the 3rd post operative month, there was improvement in SPECT segmental scores, SSS (18.38±7.51 vs. 15.31±7.29, P=0.003) and SRS (11.92±7.49 vs. 8.53±6.68, P=0.002). The ischemic area extension, however, had non-significant variation (23.38±13.12 percent vs. 20.08±13.88 percent, P=0.1). Stress tests METs varied from 7.66±4.47 pre to 10.29±4.36 METs post-op (P=0.08). QOL score improved from 48.23±18.35 pre to 30.15±20.13 post-op points (P=0.02). NYHA class was 3.15±0.38 pre vs. 1.77±0.83 post-op (P=0.001) and angina CCS class, 3.08±0.64 vs. 1.77±0.83 (P=0.001). CONCLUSIONS: Intramyocardial VEGF165 therapy for refractory angina, in this small trial of no option patients, resulted feasible and safe. Early clinical and scintilographic data showed improvements in symptoms and myocardial perfusion, with regression of ischemia severity in treated areas.

Transformación de embriones somáticos de mango por biobalística / Transformations of somatic embryos of mango for biobalistica

Con la finalidad de transformar genéticamente mango mediante biobalística, se bombardearon ambriones somáticos de variedades Haden, Francis y Kent. Se determinó la dosis máxima de PPT en que los embriones somáticos sobreviven, cultivándolos en el medio Gamborg, Miller y Ojima en concentraciones de 0; 0,5; 1 y 2mg/l de PPT durante tres meses y subcultivado mensualmente para evaluar peso fresco y seco. Los embriones somáticos fueron bombardeados con el plásmido CAMBIA 3201 que contiene los genes que los genes GUS y BAR, con dos tamaños de partículas de tungsteno (0,7 y 1,3um), presión de 80psi, distancias de bombardeo (10,0 y 15,5cm) y 5ug de ADN. Se seleccionaron los embriones transformados en medio Gamborg, Miller y Ojima con 0,5mg/l de PPT. Las condiciones de bombardeo escogidas fueron el tamaño de partículas de 0,7um y la distancias de bombardeo de 16,5cm. Después de tres meses de selección en las concentraciones de PPT utilizadas se hizo evidente la sobrevivencia de los embriones transformados en la variedad Kent, mientras que los embriones no transformados sobrevivieron en concentración de 0,5mg/l. Las variedades Hadem y Madame Francis fueron sensibles a las condiciones de bombardeo y selección suministrados, muriendo después en este proceso. Se logró una sobrevivencia de 4 por ciento y la regeneración de 3 clones por 0,5g de tejido bombardeado. Se evidenció la actividad enzimática de la expresión transitoria del gen GUS pero no la estable y la incorporación de los genes GUS y BAR mediante PCR

Inducción de arteriogénesis mediante la transferencia génica de factor de crecimiento de endotelio vascular de 165 aminoácidos en cerdos crónicamente isquémicos / Arteriogenesis induced by vascular endothelial growth factor 165 gene transfer in chronically ischemic pigs

El factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), un angiógeno considerado específico de los endoteliocitos, mejora la perfusión miocárdica en animales y en seres humanos con cardiopatía isquémica. Dado que la perfusión tisular depende principalmente de la irrigación arterial y de que los receptores para VEGF se encontraron recientemente en células musculares lisas, la administración de VEGF debería promover también la arteriogénesis. Nuestro objetivo fue el de estudiar el probable efecto arteriogénico de la administración de un nuevo plásmido codificante para VEGF recombinante humano (pCMVrhVEGF165), desarrollado y producido en la Argentina, en cerdos con isquemia miocárdica crónica. Tres semanas después de la colocación de un oclusor Ameroid en la arteria circunfleja, 16 cerdos fueron sometidos a estudios de función miocárdica (ecocardiografía estrés con dobutamina) y distribuídos al azar en un grupo tratado (n = 8) que recibió 10 inyecciones intramiocárdicas de pCMVrhVEGF165 (3,8 mg) y un grupo placebo (n = 8) que recibió el plásmido desprovisto del gen. A las 5 semanas se repitió la ecocardiografía, se realizó una cinecoronariografía y se extrajeron el corazón y los tejidos remotos para su análisis histopatológico. La clave se ocultó hasta el fin del análisis estadístico. El grupo tratado presentó, con respecto al placebo, mayor densidad de longitud (2,4 ñ 0,4 versus 1,3 ñ 0,3 mm/mmü; p< 0,02) y numérica (1 ñ 0,1 versus 0,6 ñ 0,1 mm², p <0,02) de vasos pequeños (<50 µm) provistos de túnica muscular lisa evidenciable mediante inmunohistoquímica. No se halló proliferación vascular indeseada en tejidos remotos. Concluímos que en cerdos crónicamente isquémicos la inyección intramiocárdica directa de pCMVrhVEGF165 es segura e induce arteriogénesis en el miocardio isquémico